DNA的合成、組裝及轉移技術
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酶促從頭合成法
目前亞磷酰胺法是商業化?Oligo?合成的主流方法，但其合成的長度限制在?200?nt?左右，而且合成過程中亦會大量使用有毒化學試劑。由于在合成準確性及不需要使用毒性化合物等方面的潛在優勢，酶促合成方法受到了越來越多的關注。酶促法從頭合成寡聚核苷酸的提出至少可以追溯到?20?世紀?60?年代。與化學法相比，酶促法的作用條件溫和，對?DNA?的損傷較少，有助于準確性的提高，同時減少了副產物的產生，可實現更長?Oligo?的合成。然而，酶促法的發展緩慢，至今未能實現商業化。根據?Jensen?和?Davis對?DNA?酶促從頭合成發展的總結，末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT）介導的酶促合成法是較好的選擇，但還需要更進一步優化。TdT?介導的?DNA?合成技術開發中首先需要解決單個?dNTP?添加后的終止效率及末端重新活化的問題。近期，Palluk?等提出了一種解決方案，他們將?dNTP?通過可光誘導剪切的連接子與?TdT?連接，所得?dNTP-TdT?復合物可在?10—20?s?的時間完成?DNA?鏈的延伸，而且可以重復進行，實現特定?DNA?鏈的合成。該方法將為具有實際應用價值的酶促?DNA?合成法的開發打下基礎。
合成?DNA?拼裝技術
受當前合成技術的限制，目標基因組只能以短鏈?Oligo?的形式得以從頭合成，依賴后續的逐步拼接才能獲得。根據原理區別，以下對現有的?DNA?拼接技術進行了分類總結。
胞外組裝
根據組裝片段的大小、序列特性、是否接受額外序列殘留等，目前有眾多的策略可以采用。而眾多體外?DNA?組裝技術的共同點在于均需要工具酶的使用，以實現?DNA?鏈的切割、單鏈黏性末端的產生、雙鏈連接及缺口的補齊等。本文根據所用工具酶體系的不同將其歸為?5?類。
基于DNA聚合酶的策略。該方法首先合成有互補配對重疊區的?Oligo，利用?PCR?擴增的原理，可以對有互補重疊區的?Oligo?進行延伸連接獲得小?DNA?片段，然后小?DNA?片段以重疊?PCR?的方式進行逐步連接獲得目的?DNA?片段，以其作為模板，進一步?PCR?擴增可以大量獲得目的片段（圖?2a）。此方法（polymerase cycling assembly，PCA）無須依賴額外的?DNA?連接酶，直接從人工合成的?Oligo?開始組裝，操作簡單、快速。Stemmer等曾用此法實現基因及質粒的一步拼裝。Smith?等則通過增加?Taq?連接酶的步驟用此法合成了?ФX174?噬菌體的基因組。