人工基因線路的研究進展和未來挑戰
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人工基因線路設計的挑戰
使用人工基因線路執行控制功能時，需要將該線路裝載到不同的底盤生物中。不同領域的應用對底盤生物需求的多樣性要求人工基因線路對底盤生物的適應性。為了達到此目標，需要對人工基因線路進行“模塊化”設計?！澳K化”是合成生物學元件的核心屬性之一，設計目標是將生物系統拆解為功能上相互獨立的模塊，并保證模塊間的拼裝不會導致模塊功能的改變。模塊化設計能使構建的生物系統像電子系統一樣進行規模擴展和尺度放大，因此合成生物學領域的大量工作都注重模塊化元件的開發。然而，事實遠比設想中復雜?；蚧芈凡⒉荒車栏竦睾退拗骷毎綦x，而是與細胞的生理狀態耦合形成一個整體，人工基因線路會對細胞生理產生一些不可預知的干涉性影響，而這些干涉性影響也使理論上“模塊化”的生物元件和基因線路失去了可預測性，不再“模塊化”。這就導致在一種生物中精細刻畫過的元件性質并不能在另一種生物中直接成立，因為元件一旦脫離了刻畫時的細胞生理狀態，其行為就有可能偏離預期。如果不能克服這個問題，合成生物元件就不能像電子元件一樣使用簡單元件逐步搭建復雜線路，而是需要耗費大量時間和精力對單個底盤生物中的元件進行點對點的優化。目前，人工基因線路的設計挑戰主要表現在兩個方面：①人工基因元件過表達引發細胞生長壓力和細胞毒性；②細胞體內存在一些會影響人工基因線路功能的特殊生理機制。
人工基因線路過表達引發細胞生長壓力和細胞毒性
細胞利用有限的資源完成營養物質攝取、能量代謝、DNA?復制、細胞分裂等諸多生理過程。為了優化自身的生長，細胞需要根據環境平衡分配這些資源。當人工基因線路的加入打破了這種平衡，就可能引發細胞生長壓力（burden），影響細胞的正常生長。細胞的生長壓力主要表現在兩個方面：①人工基因線路在蛋白表達過程中占用了底盤細胞的?RNA?聚合酶和核糖體，以及相關的輔酶、能量等資源。②過量表達蛋白還可能引起細胞的應激反應，激活一些細胞應激途徑如?ppGpp?等。除了生長壓力，人工基因線路還可能帶來細胞毒性（toxicity）。與生長壓力不同，細胞毒性產生的原因是人工基因線路調控過程中的脫靶效應對底盤細胞的正常生理活動產生的干擾，而非由于對細胞內基礎資源的占用。
當底盤細胞因為生長壓力或細胞毒性而生長減緩時，會反過來對其內部人工基因線路的可預測性和遺傳穩定性產生負面影響。例如，基于?TetR?家族阻遏蛋白設計的元件中，一些阻遏蛋白可能會與底盤細胞基因組上非特異靶位點的結合，從而影響底盤細胞的生長，同時也降低了這些元件的可預測性。此外，在細胞培養過程中，人工基因線路的序列可能產生各種隨機突變。通常這些突變帶來的影響非常小，但如果某種突變體為其所在的細胞帶來了生長優勢，就會很快占據群落的主體，使人工基因線路在群體層次上失效。例如，一種基于群體感應設計的、控制細胞群體大小的元件在傳代培養?3—6?天后，就由于逃脫調控的突變體發生大量增殖而失效。
許多已經廣泛使用的優質元件也因為自身的細胞毒性限制了其發揮和推廣。例如，CRISPRi-dCas9（CRISPR interference-dCas9）調控系統被認為是優秀的可編程的調控元件，目前已被廣泛用于基因線路的構建。然而，隨著?dCas9?表達量升高，細胞生長會出現明顯的遲滯。一些研究者認為該毒性來源于?CRISPR?的脫靶效應。因而在?CRISPRi-dCas9?的實際使用過程中，研究者需要耗費大量精力來平衡轉錄調控開關的正面影響與其對細胞生長的負面影響。合成生物學的元件設計最終要針對下游應用問題進行調整，而下游應用需要宿主細胞健康、快速生長，因此元件的細胞毒性將是合成生物學走向應用的瓶頸問題之一。